Биология клетки/Часть 1. Клетка как она есть/3/1

	Глава 3.1	Следующая глава →
Роль ДНК в клетке и история её открытия

Нуклеиновые кислоты открыл Ф. Мишер в XIX веке

ДНК как представитель отдельного класса органических веществ — нуклеиновых кислот — была открыта швейцарским врачом и биологом Фридрихом Мишером в 1869 г. Мишер изучал химический состав гноя — погибших клеток-лейкоцитов. Ему удалось выделить из ядер лейкоцитов вещество, не расщепляемое протеазами, не растворяющееся в эфире и содержащее большое количество фосфора. Мишер назвал его «нуклеин» (от слова «нуклеус» — ядро) (когда это вещество было переименовано в «нуклеиновую кислоту», это вызвало большое недовольство Мишера). Позднее Мишеру удалось найти удобный материал для выделения ДНК — молоки лососевых рыб (для выделения больших количества ДНК их используют до сих пор, так как процентное содержание ДНК в сперматозоидах гораздо выше, чем в любых других клетках).

А. Вейсман предположил, что существует «бессмертная» зародышевая плазма — особое вещество наследственности

В конце 19-ого века А. Вейсман высказал гипотезу, что существует особое «наследственное вещество», которое он назвал зародышевой плазмой. Она, как предполагал Вейсман, находится в хромосомах, а её элементы располагаются в линейном порядке. Две гипотезы, которые он выдвинул, подтвердились в ходе развития генетики:

1) Вейсман предположил, что зародышевая плазма содержится только в половых клетках и отсутствует в соматических (клетках тела). Как предполагал Вейсман, зародышевая плазма не зависит от того, что происходит с соматическими клетками (приобретенные признаки не наследуются). Для доказательства этой теории Вейсман проводил опыты на мышах. В двадцати поколениях мышам подрезали хвосты, но при этом у их детенышей хвосты короткими не становились. Этот несколько наивный опыт в то время рассматривался как важное доказательство того, что приобретенные признаки не наследуются: клетки тела не могут сообщить половым клеткам о происходящих с ними изменениях.

2) Идея Вейсмана о роли хромосом и о линейном расположении в них элементарных единиц наследственности оказалась верной и сохранилась в науке до наших дней, изменилась только терминология.

Генетические опыты на дрозофиле показали, что гены расположены в хромосомах в линейной последовательности

Открытие кроссинговера (обмена участками между гомологичными хромосомами) не только внесло поправку в представления о сцепленном наследовании. После этого открытия ученые смогли изучить расположение генов в хромосоме. Идея была предложена ученым Т. Х. Морганом и его сотрудником Стертевантом. Они предположили, что: 1) Хромосома представляет собой линейную структуру. 2) Гены в хромосоме расположены линейно, как бусины на нитке. 3) Точка пересечения хромосом при кроссинговере лежит в любом месте хромосом.

Из этих предположений можно сделать вывод, что чем дальше гены расположены друг от друга, тем чаще будет наблюдаться кроссинговер, чем гены ближе друг к другу, тем кроссинговер будет наблюдаться реже. Если гены лежат на разных концах хромосомы, то при каждом перекрещивании гены разойдутся в разные хромосомы, но если гены расположены близко друг к другу, то кроссинговер будет происходить только если точка перекреста хромосом окажется на коротком участке, находящемся между ними, то есть редко.

Если изучать кроссинговер трех генов, то можно определить расстояние между ними по частоте кроссинговеров. Морган скрещивал самок дрозофил с рецессивными генами w (белые глаза), y (желтый цвет тела) и bi (вильчатые крылья). При этом частота кроссинговеров между генами y и w составила 1,2 %, между генами w и bi — 3,5 %, между генами y и bi — 4,7 %. Из этого можно сделать вывод, что ген w находится между генами y и bi, причем расстояние между данными генами пропорционально проценту кроссинговеров меду ними.

Н. К. Кольцов предсказал, что наследственная информация записана на молекулярном уровне, а наследственные молекулы размножаются с помощью матричного принципа

В 1927 году Н. К. Кольцов, выступая с докладом, прибавил к двум уже существующим биологическим принципам («Omne vivum ex ovo», «Omnis cellula ex cellula») третий — «Omnis molecula ex molecula» — «Всякая молекула от молекулы». Речь шла о «наследственных молекулах», которые, как считал Кольцов, несут наследственную информацию. По представлениям Кольцова, «наследственные молекулы» — это белковые макромолекулы огромной длины; информация в них шифруется последовательностью аминокислот. При удвоении хромосом информация копируется по матричному принципу: исходная молекула служит матрицей, по которой строится её копия. В том, что наследственная информация закодирована в белках, Кольцов ошибся (одной из причин этого было кажущееся исчезновение ДНК при позднем овогенезе и в гигантских хромосомах). Зато в том, что «наследственная молекула» удваивается по матричному принципу, он оказался прав.

Э. Шрёдингер стимулировал интерес биологов к физической природе наследственности

Эрвин Шрёдингер — один из создателей квантовой механики — в 1944 г. написал книгу «Что такое жизнь? С точки зрения физика». В этой книге автор подробно описывает строение хромосом и их функцию. Он подробно разобрал явление мутаций и их причины. Также он разработал некоторые положения теории наследственности. Вот некоторые выдержки из его книги: «Именно эти хромосомы или, возможно, только осевая или скелетная нить того, что мы видим под микроскопом как хромосому, содержат в виде своего рода шифровального кода весь „план“ будущего развития индивидуума и его функционирования в зрелом состоянии. Каждый полный набор хромосом содержит весь шифр, поэтому, как правило, имеются две копии последнего в оплодотворенной яйцеклетке, которая представляет самую раннюю стадию будущего индивидуума…»

«Называя структуру хромосомных нитей шифровальным кодом, мы подразумеваем, что всеохватывающий ум, вроде такого, который некогда представлял себе Лаплас и которому каждая причинная связь непосредственно открыта, мог бы, исходя из структуры хромосом, сказать, разовьется ли яйцо при благоприятных условиях в черного петуха или в крапчатую курицу, в муху или растение маиса, в рододендрон, жука, мышь или человека…»

По этим цитатам видно, что Шредингер разбирал темы, которые раньше почти не затрагивались биологической теорией. Здесь Шредингер впервые использует для хромосом термин «наследственный шифровальный код». Шрёдингер был знаменитым физиком, и его книга вызвала неподдельный интерес у других представителей естественных наук, в том числе у биологов, хотя многие не сразу оценили ее значение.

[1] Э.Шредингер. Что такое жизнь? С точки зрения физика. (Русский перевод)

Ф. Гриффит открыл трансформацию: вещества убитых бактерий могут вызывать изменение наследственных свойств других штаммов, проникая в их клетки

Схема опыта Гриффита. Rough strain — шероховатый штамм (невирулентный), smooth strain — гладкий штамм (вирулентный)

.

Фредерик Гриффит, 1936.

Немецкий бактериолог Фред Нойфельд впервые описал штаммы пневмококка Streptococcus pneumoniae. Среди колоний вирулентных (способных вызывать заболевание) пневмококков, имеющих гладкую поверхность (R-штамм) изредка в результате мутации появляются шероховатые колонии невирулентного S-штамма. Утрата болезнетворности связана с тем, что мутантные пневмококки не синтезируют полисахаридную капсулу. Сейчас известно, что полисахаридная капсула препятствует опсонизации и последующему фагоцитированию бактерий.

До эпохи антибиотиков пневмония была грозной, часто смертельной болезнью. Нужно отметить, что и сегодня пневмония занимает одно из первых мест среди инфекционных болезней как причина смертности. В наши дни существует и в некоторых странах широко применяется вакцина от пневмонии.

Английский врач и генетик Фредерик Гриффит начал опыты, приведшие к открытию трансформации, а надежде получить вакцину от пневмонии. Пневмококки — один из самых обычных возбудителей, которые вызывают эту болезнь. Результаты своих экспериментов Ф. Гриффит опубликовал в 1928 году.

Гриффит брал два штамма пневмококков: капсульный и бескапсульный. Капсульный — патогенный (болезнетворный), при инфицировании таким штаммом мыши погибают через 1-2 дня, бескапсульный — непатогенный. При введении мышам смеси убитых нагреванием (и, следовательно, потерявших болезнетворность) капсульных пневмококков и живых бескапсульных (непатогенных) бактерий животные погибали в результате размножения в их организме капсульных болезнетворных форм.

Следовательно, убитые пневмококки с капсулой каким-то образом передавали свой наследственный признак (способность синтезировать капсулу) бескапсульному штамму. Эта способность сохранялась и у последующих поколений при разведении. Обнаруженное явление Гриффит назвал трансформацией.

Описание опытов Гриффита:

1) После заражения пневмококками капсульного патогенного(штамма мыши погибают. Капсульные пневмококки размножаются в их крови и могут быть выделены в чистую культуру.

2) При инфицировании пневмококками бескапсульного непатогенного штамма животные не погибают. Бескапсульные пневмококки уничтожаются иммунной системой мыши и не обнаруживаются в её крови.

3) После заражения пневмококками капсульного патогенного штамма, предварительно убитыми нагреванием, мыши не погибают. Убитые пневмококки, естественно, не размножаются.

4) При введении мышам одновременно бескапсульных неболезнетворных пневмококков и капсульных, убитых нагреванием, животные погибают. Бескапсульные пневмококки становятся капсульными и размножаются в организме мыши. выделенные из её организма в чистую культуру, они и в последующих попоклениях сохраняют способность синтезировать капсулу.

Бескапсульные неболезнетворные пневмококки приобрели наследуемый признак убитых капсульных бактерий — произошла трансформация.

В 1941 г Ф. Гриффит погиб в своей лаборатории в пригороде Лондона во время бомбежки.

До исследований Гриффита бактериологи полагали, что штаммы не изменяются от поколения к поколению. Данные, полученные Гриффитом, позднее были подтверждены Фредом Нойфельдом в Институте Коха и Мартином Генри Доусоном в Институте Рокфеллера. Мартин Генри совместно с Ричардом Сиа разработал метод трансформации клеток бактерий in vitro (эксперимент Гриффита был проделан в условиях in vivo). После отъезда Доусона в 1930 году Джеймс Эллоуэй в 1933 году предпринял попытки продолжить исследования Гриффитса и получить водный экстракт трансформирующего агента. Колин Маклеод работал над выделением этих водных растворов с 1934 по 1937 год, исследования по выделению фракций были продолжены в 1940 году и завершены Маклином Маккарти.

В 1944 г. эта серия экспериментов была завершена Освальдом Эйвери, Колином МакЛеодом и Маклином МакКарти. Они смешивали бескапсульных пневмококков со взятыми от капсульных белками, полисахаридами или ДНК. При введении смеси из бескапсульных пневмококков и белков или полисахаридов животные оставались живы; значит, наследственная информация в них не содержится. А при введении смеси из бескапсульных пневмококков и ДНК мыши умирали; значит, именно в ДНК и записана информация, определяющая способность синтезировать капсулу.

Опыт Эйвери, МакЛеода и МакКарти доказал, что трансформирующее начало — ДНК

Эксперимент Освальда Эвери, Колина Маклеод и Маклина Маккарти, произведенный в 1944 году, доказал что ДНК является веществом, вызывающим трансформацию клеток бактерий, то есть передает некоторый наследственный признак.

Эксперимент Эвери, Маклеода и Маккарти стал кульминацией исследований, проводившихся в Рокфеллеровском институте медицинских исследований в 1930-х — 1940-х годах и начатых экспериментом Гриффита в 1928 году. В эксперименте Гриффита убитые пневмококки штамма III-S (обладают олигосахаридной капсулой, вирулентные), введенные в кровь мыши с живыми пневмококками штамма II-R (безкапсульные, невирулентные), вызывали инфекцию типа III-S (мышь погибала). В статье, опубликованной в феврале 1944 года в Журнале экспериментальной медицины, Эвери с соавторами показали, что ДНК, но не белки являются веществом, отвечающим за передачу наследственных признаков у бактерий.

Освальд Эвери

В ходе эксперимента болезнетворные пневмококки, имеющие капсулу, были убиты нагреванием. Для выделения ДНК было произведено осаждение белков хлороформом. Полисахаридные капсулы, обуславливающие вредные свойства бактерий, были гидролизованы специфичным ферментом. Из оставшейся части экстракта были выделены прозрачные тяжи. Химический анализ показал, что соотношение в них атомов углерода, водорода, азота и фосфора соответствует соотношению этих же атомов в молекуле ДНК. Для подтверждения того, что действующим началом трансформации является именно ДНК, а не РНК, белки или другие компоненты клетки, Эвери с сотрудниками добавляли к выделенному веществу трипсин (расщепляет пептиды и белки) и рибонуклеазу (разрушает РНК), но это никак не влияло на трансформирующие свойства. Лишь обработка ДНКазой (разрушает ДНК) приводила к разрушению трансформирующего начала.

Опыт Херши и Чейз: при заражении бактерий бактериофаг вводит внутрь клетки ДНК, но не белки

Эксперимент Херши—Чейз окончательно доказал, что носитель генетической информации — это ДНК. Эксперимент состоял из серии опытов, которые были проведены в 1952 году американскими генетиками Алфредом Херши и Мартой Коулз Чейз. Хотя ДНК была известна ещё с 1869 года, ко времени эксперимента многие учёные считали, что наследственная информация находится в белках.

Схема эксперимента Херши—Чейз.

Эксперимент проводился на бактериофаге T2, структура которого к тому времени была выяснена с помощью электронной микроскопии. Оказалось, что бактериофаг состоит из белковой оболочки, внутри которой находится ДНК. Эксперимент был спланирован таким образом, чтобы выяснить, что же — белок или ДНК — является носителем наследственной информации.

Херши и Чейз выращивали две группы бактерий: одну в среде, содержащей радиоактивный фосфор-32 в составе фосфат-иона, другую — в среде с радиоактивной серой-35 в составе сульфат-иона. Бактериофаги, добавленные в среду с бактериями и размножавшиеся в них, поглощали эти радиоактивные изотопы, которые служили маркёрами, при построении своей ДНК и белков. Фосфор содержится в ДНК, но отсутствует в белках, а сера, наоборот, содержится в белках (точнее в двух аминокислотах: цистеин и метионин), но её нет в ДНК. Таким образом, одни бактериофаги содержали меченые серой белки, а другие — меченую фосфором ДНК.

После выделения радиоактивно-меченых бактериофагов их добавляли к культуре свежих (не содержащих изотопов) бактерий и позволяли бактериофагам инфицировать эти бактерии. После этого среду с бактериями подвергали энергичному встряхиванию в специальном смесителе (было показано, что при этом оболочки фага отделяются от поверхности бактериальных клеток), а затем инфицированных бактерий отделяли от среды. Когда в первом опыте к бактериям добавлялись меченые фосфором-32 бактериофаги, оказалось, что радиоактивная метка находилась в бактериальных клетках. Когда же во втором опыте к бактериям добавлялись бактериофаги, меченые серой-35, то метка была обнаружена во фракции среды с белковыми оболочками, но её не было в бактериальных клетках. Это подтвердило, что материалом, которым инфицировались бактерии, является ДНК. Поскольку внутри инфицированных бактерий формируются полные вирусные частицы, содержащие белки вируса, данный опыт был признан одним из решающих доказательств того факта, что генетическая информация (информация о структуре белков) содержится в ДНК.

В 1969 году Алфред Херши получил Нобелевскую премию за открытия генетической структуры вирусов.

[2] Анимация «Опыт Эйвери, Маклеода и Маккарти (трансформирующее начало — это ДНК)» (англ.)